近日，我校生物学院高宏波教授课题组在最新一期的植物学高水平国际期刊《Plant Communications》（一区，IF="10.5）发表了题为“A new method based on the release of fluorescent protein tag by TEV protease for studying the orientation of membrane proteins in plants”的研究论文，开发出了一种研究植物膜蛋白在细胞中的定位取向的新方法。

真核生物的细胞具有复杂的膜系统和多种膜性细胞器，在这些膜上含有许多具有重要功能的蛋白质，它们多数都含有一个或多个跨膜结构域。膜蛋白在膜上定位的方向是决定其功能的一个关键因素，影响着其工作机制、与其他蛋白的相互作用以及功能的实现。

经典的研究膜蛋白定位取向的方法是分离细胞器或细胞组分然后进行蛋白酶切等生化分析，但是该方法操作起来并不容易。荧光蛋白酶保护(FPP)实验是一种新兴且被广泛使用的研究膜蛋白取向的方法。然而，该方法基于动物细胞，在植物膜蛋白的分析研究中效果不好。

高宏波教授课题组利用烟草蚀刻病毒(TEV)蛋白酶定点切割并释放荧光蛋白标签(RFT)，开发出了一种更简单有效的分析植物细胞中膜蛋白取向的方法。该方法通过构建融合蛋白载体，将黄色荧光蛋白（YFP）添加到感兴趣的膜蛋白的N端或C端，并在膜蛋白和YFP之间加入TEV蛋白酶识别和切割序列ENLYFQS。在植物细胞中共表达融合蛋白和TEV蛋白酶，当融合蛋白暴露于胞质中的TEV蛋白酶时，YFP要么被膜保护，要么从膜上释放，这取决于每个膜蛋白的定位取向和末端的位置（图1）。

图1.利用RFT方法分析膜蛋白定位取向的原理示意图

通过荧光显微镜观察荧光蛋白定位的变化或不同，可以很容易地推断出融合蛋白在膜上的定位取向（图2）。结合Western blot分析，该方法可以进一步验证上述显微观察结果。

图2.内质网膜蛋白CNX1的定位取向分析

RFT方法理论上也可以应用于动物细胞。此外，RFT方法可以经过一些修改并应用到更广泛的研究中去，例如，改变蛋白质的亚细胞定位，激活或破坏一个蛋白质。

高宏波教授为该研究论文的通讯作者，博士研究生胡静蕾和常宁为共同第一作者。该研究得到了中央高校基本科研业务费专项资金和国家自然科学基金的资助。

论文链接：https://www.cell.com/plant-communications/fulltext/S2590-3462(23)00113-X#